Рибосомный дисплей - Ribosome display - Wikipedia

Рибосомный дисплей это техника, используемая для выполнения in vitro белок эволюция для создания белков, которые могут связываться с желаемым лиганд. Процесс приводит к транслированным белкам, которые связаны с их мРНК предшественник, который используется в виде комплекса для связывания с иммобилизованным лигандом на этапе отбора. Гибриды мРНК-белок, которые хорошо связываются, затем обратная расшифровка к кДНК и их последовательность амплифицирована через ПЦР.[1] Конечный результат - это нуклеотид последовательность, которую можно использовать для создания прочно связывающихся белков.

Процесс отображения рибосом

Отображение рибосом начинается с нативной библиотеки последовательностей ДНК, кодирующих полипептиды.[2] Каждая последовательность транскрибируется, а затем переводится in vitro в полипептид. Однако библиотека ДНК, кодирующая конкретную библиотеку связывающих белков, генетически слита со спейсерной последовательностью, не имеющей стоп-кодона перед ее концом. Отсутствие стоп-кодона предотвращает факторы выпуска от связывания и запуска разборки трансляционного комплекса. Таким образом, эта спейсерная последовательность остается прикрепленной к пептидил тРНК и занимает рибосомный туннель и, таким образом, позволяет интересующему белку выступать из рибосомы и складываться. В результате получается комплекс мРНК, рибосомы и белка, который может связываться с поверхностно связанным лигандом. Этот комплекс стабилизируется при понижении температуры и добавлении катионов, таких как Mg.2+.

Во время последующих стадий связывания или пэннинга комплекс вводят в поверхностно связанный лиганд. Это можно сделать несколькими способами, например, используя аффинная хроматография колонка со слоем смолы, содержащей лиганд, 96-луночный планшет с иммобилизованным поверхностно-связанным лигандом или магнитные шарики, покрытые лигандом. Комплексы, которые хорошо связываются, иммобилизуются. Последующее элюирование связывающих веществ с помощью высоких концентраций солей, хелатирующих агентов или мобильных лигандов, которые образуют комплекс со связывающим мотивом белка, позволяют диссоциацию мРНК. Затем мРНК может быть обратно транскрибирована обратно в кДНК, подвергаться мутагенез, и итеративно подается в процесс с более высоким давлением отбора, чтобы изолировать еще лучшие связующие.

Преимущества отображения рибосом

Благодаря тому, что предшественник белка присоединен к комплексу, процессы отображения рибосом пропускают микрочип / пептидная гранула / разделение последовательностей с несколькими лунками, которое является обычным в анализах с участием нуклеотидов гибридизация и предоставляет готовый способ амплификации белков, которые связываются, без расшифровки последовательности до тех пор, пока это необходимо. В то же время этот метод основан на создании больших, концентрированных пулов разнообразия последовательностей без пробелов и предотвращении деградации, гибридизации и реакции этих последовательностей друг с другом способами, которые могут создать пробелы в пространстве последовательностей.

Он имеет успешный послужной список в разработке антител.[3] и протеиновый терапевтический [4] ведет и до сих пор широко используется в этих областях.

Конкурирующие методы эволюции белка in vitro находятся фаговый дисплей, дрожжевой дисплей, бактериальный дисплей, и отображение мРНК.[5] пептиды (Маттеакис, Бхатт и Доу). Поскольку он проводится полностью in vitro, есть два основных преимущества перед другими технологиями отбора. Во-первых, разнообразие библиотеки не ограничивается эффективностью трансформации бактериальных клеток, а только количеством рибосом и различных молекул мРНК, присутствующих в пробирке. Во-вторых, случайные мутации могут быть легко введены после каждого раунда отбора, поскольку никакая библиотека не должна трансформироваться после любого этапа диверсификации. Это позволяет легко направлять эволюцию связывающих белков в течение нескольких поколений.

Предпосылкой для выбора белков из библиотек является сочетание генотипа (РНК, ДНК) и фенотипа (белок). В рибосомном дисплее эта связь осуществляется во время трансляции in vitro за счет стабилизации комплекса, состоящего из рибосомы, мРНК и формирующегося, правильно уложенного полипептида. Рибосомным комплексам позволяют связываться с иммобилизованной на поверхности мишенью. В то время как несвязанные комплексы вымываются, мРНК комплексов, отображающих связывающий полипептид, может быть восстановлена, и, таким образом, генетическая информация связывающих полипептидов доступна для анализа.

Смотрите также

Рекомендации

  • Hanes, J .; Plückthun, A. (1997). «Отбор и эволюция функциональных белков in vitro с использованием рибосомного дисплея». Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 94 (10): 4937–42. Дои:10.1073 / pnas.94.10.4937. ЧВК  24609. PMID  9144168.
  • Липовсек, Д .; Plückthun, A. (2004). «Эволюция белка in vitro путем отображения рибосом и отображения мРНК». J. Imm. Методы. 290 (1–2): 51–67. Дои:10.1016 / j.jim.2004.04.008. PMID  15261571.
  • Он, М .; Тауссиг, М. (2007). «Отображение эукариотических рибосом с восстановлением ДНК in situ». Методы природы. 4 (3): 281–288. Дои:10.1038 / nmeth1001. PMID  17327849. S2CID  7293661.
  1. ^ X Ян; З. Сюй (2006). «Технология отображения рибосом: приложения для направленной эволюции функциональных белков». Открытие наркотиков сегодня. 11 (19–20): 911–916. Дои:10.1016 / j.drudis.2006.08.012. PMID  16997141.
  2. ^ L C Mattheakis; Р. Р. Бхатт и В. Дж. Дауэр (сентябрь 1994 г.). «Система полисомного дисплея in vitro для идентификации лигандов из очень больших библиотек пептидов». Труды Национальной академии наук. 91 (19): 9022–6. Дои:10.1073 / пнас.91.19.9022. ЧВК  44739. PMID  7522328.
  3. ^ Джермутус, Лутц; Онеггер, Аннемари; Швезингер, Фальк; Ханес, Йозеф; Плюктун, Андреас (2001-01-02). «Адаптация эволюции in vitro к белковому сродству или стабильности». Труды Национальной академии наук. 98 (1): 75–80. Дои:10.1073 / пнас.98.1.75. ISSN  0027-8424. ЧВК  14547. PMID  11134506.
  4. ^ Бьюкенен, Эндрю; Ферраро, Франко; Раст, Стивен; Шридхаран, Судхарсан; Франкс, Рут; Дин, Грег; Маккорт, Мэтью; Джермутус, Лутц; Минтер, Ральф (31 августа 2012 г.). «Улучшенные лекарственные свойства терапевтических белков путем направленной эволюции». Разработка и отбор протеинов. 25 (10): 631–638. Дои:10.1093 / белок / gzs054. ISSN  1741-0126. ЧВК  3449403. PMID  22942395.
  5. ^ Цзин Д., Ли Ф, Цзян М., Цай Дж, Ву И, Се К., Ву Х, Тан Ц, Лю Дж, Го В., Шен Дж, Ло Э (ноябрь 2013 г.). «Импульсные электромагнитные поля улучшают микроструктуру и прочность костей у крыс с удаленными яичниками». PLOS ONE. 8 (11): e79377. Дои:10.1371 / journal.pone.0079377. ЧВК  3828367. PMID  24244491.