Брэдфордский анализ белка - Bradford protein assay

Эта статья о научной методике. Для использования в других целях см. Брэдфорд (значения).

В Брэдфордский анализ белка был разработан Мэрион М. Брэдфорд в 1976 г.[1] Это быстрый и точный[2] спектроскопический аналитическая процедура, используемая для измерения концентрации белок в растворе. Реакция зависит от аминокислотного состава измеряемых белков.

Принцип

Рис. 1. Кумасси бриллиантовый синий G-250, связующий краситель для метода Брэдфорда.
Цветная реакция белка и реактива Брэдфорда

Тест Брэдфорда, а колориметрический белок проба, основан на поглощение сдвиг красителя Кумасси бриллиантовый синий G-250. Краситель Coomassie Brilliant Blue G-250 существует в трех формах: анионной (синий), нейтральной (зеленый) и катионной (красный).[3] В кислых условиях красная форма красителя превращается в синюю форму, связываясь с исследуемым белком. Если нет белка для связывания, раствор останется коричневым. Краситель образует прочный нековалентный комплекс с карбоксильной группой белка за счет силы Ван-дер-Ваальса и аминогруппой за счет электростатических взаимодействий.[1] Во время образования этого комплекса красная форма красителя кумасси сначала отдает свой свободный электрон ионизируемым группам белка, что вызывает нарушение нативного состояния белка и, как следствие, обнажает его гидрофобный карманы. Эти карманы в белковой третичная структура нековалентно связываются с неполярной областью красителя через первое взаимодействие связи (силы Ван дер Ваальса ), которые размещают положительные аминогруппы в непосредственной близости от отрицательного заряда красителя. Связь дополнительно усиливается за счет второго взаимодействия связи между ними, ионного взаимодействия. Когда краситель связывается с белком, он вызывает сдвиг с 465 нм до 595 нм, поэтому показания поглощения снимаются при 595 нм.[4]

В катионный (несвязанная) форма зеленая / красная и имеет спектр поглощения максимум, исторически считавшийся 465 нм. В анионный связанная форма красителя, которая удерживается вместе за счет гидрофобных и ионных взаимодействий, имеет максимум спектра поглощения, исторически считавшийся равным 595 нм.[5] Увеличение поглощения при 595 нм пропорционально количеству связанного красителя и, следовательно, количеству (концентрации) белка, присутствующего в образце.[нужна цитата ]

В отличие от других анализов белка, анализ белка Брэдфорда менее подвержен влиянию различных химических соединений, таких как натрий, калий или даже углеводов, таких как сахароза, которые могут присутствовать в образцах белка.[2] Исключение составляют повышенные концентрации моющее средство. Додецилсульфат натрия (SDS), распространенный детергент, может быть обнаружен в экстрактах белков, поскольку он используется для лизиса клеток путем разрушения липидного бислоя мембраны и денатурирования белков для SDS-СТРАНИЦА. В то время как другие детергенты мешают анализу при высокой концентрации, вмешательство, вызываемое SDS, бывает двух разных режимов, и каждый происходит при разной концентрации. Когда концентрации SDS ниже критическая концентрация мицелл (известный как CMC, от 0,00333% мас. / об. до 0,0667%) в растворе красителя кумасси детергент имеет тенденцию к прочному связыванию с белком, ингибируя сайты связывания с белком для красителя. Это может вызвать недооценку концентрации белка в растворе. Когда концентрации SDS выше CMC, детергент прочно связывается с зеленой формой красителя Кумасси, вызывая смещение равновесия, тем самым производя больше синей формы. Это вызывает увеличение поглощения при 595 нм независимо от присутствия белка.[нужна цитата ]

Другие помехи могут исходить от буфера, используемого при подготовке образца белка. Высокая концентрация буфера приведет к завышению концентрации белка из-за истощения свободных протонов из раствора конъюгированным основанием из буфера. Это не будет проблемой, если используется низкая концентрация белка (впоследствии буфер).[нужна цитата ]

Чтобы измерить оптическую плотность бесцветного соединения, необходимо провести анализ Брэдфорда. Некоторые бесцветные соединения, такие как белки, могут быть определены количественно при оптической плотности 280 нм из-за присутствия ароматических колец, таких как триптофан, тирозин и фенилаланин, но если ни одна из этих аминокислот не присутствует, то поглощение при 280 нм невозможно измерить.[6]

Преимущества

Многие белковые растворы имеют максимальное поглощение при 280 нм в спектрофотометре в УФ-диапазоне. Для этого требуются спектрофотометры, способные выполнять измерения в УФ-диапазоне, чего многие не могут. Кроме того, максимум поглощения при 280 нм требует, чтобы белки содержали ароматические аминокислоты, такие как тирозин (Y), фенилаланин (F) и / или триптофан (W). Не все белки содержат эти аминокислоты, что может исказить измерения концентрации. Если в образце присутствуют нуклеиновые кислоты, они также будут поглощать свет с длиной волны 280 нм, что еще больше искажает результаты. Используя анализ белка Брэдфорда, можно избежать всех этих осложнений, просто смешав образцы белка с красителем Coomassie Brilliant Blue G-250 (реагент Брэдфорда) и измерив их оптическую плотность при 595 нм, что находится в видимом диапазоне.[7]

Процедура анализа белка по Брэдфорду очень проста и понятна. Это делается за один этап, когда реагент Брэдфорда добавляется в пробирку вместе с образцом. После тщательного перемешивания смесь почти сразу приобретает синий цвет. Когда краситель связывается с белками в процессе, который занимает около 2 минут, происходит изменение максимума поглощения красителя с 465 нм до 595 нм в кислых растворах.[2] Этот краситель создает прочные нековалентные связи с белками за счет электростатических взаимодействий с амино и карбоксильными группами, а также взаимодействий Ван-дер-Ваальса. Только молекулы, которые связываются с белками в растворе, демонстрируют это изменение абсорбции, что устраняет опасения, что несвязанные молекулы красителя могут вносить вклад в экспериментально полученное значение абсорбции. Этот процесс более выгоден, поскольку он менее дорог, чем другие методы, прост в использовании и имеет высокую чувствительность красителя к белку.[8]

После 5 минут инкубации оптическую плотность можно определить при 595 нм с помощью спектрофотометр; легкодоступная машина.

Этот анализ - один из самых быстрых анализов белков.[9] Общее время, необходимое для настройки и завершения анализа, составляет менее 30 минут.[10] Весь эксперимент проводится при комнатной температуре.

Анализ белка Брэдфорда может измерять количество белка от 1 до 20 мкг.[11] Это чрезвычайно чувствительный метод.

Реагент красителя представляет собой стабильный готовый к использованию продукт, приготовленный в фосфорная кислота. Он может оставаться при комнатной температуре до 2 недель, прежде чем он начнет разлагаться.

Образцы белка обычно содержат соли, растворители, буферы, консерванты, восстановители и хелатирующие агенты с металлами. Эти молекулы часто используются для солюбилизации и стабилизации белков. Другие анализы белка, такие как BCA и Lowry, неэффективны, потому что молекулы, такие как восстановители, мешают анализу.[12] Использование Брэдфорда может быть выгодным по сравнению с этими молекулами, потому что они совместимы друг с другом и не будут мешать.[13]

Линейный график, полученный в результате анализа (поглощение в зависимости от концентрации белка в мкг / мл), можно легко экстраполировать для определения концентрации белков с помощью наклона линии.

Это чувствительный метод. Это тоже очень просто: измерить OD при 595 нм после 5 минут инкубации. В этом методе также можно использовать спектрофотометр Vis.[14]

Недостатки

Анализ Брэдфорда является линейным в коротком диапазоне, обычно от 0 мкг / мл до 2000 мкг / мл, что часто требует разбавления пробы перед анализом. При выполнении этих разведений ошибка одного разведения усугубляется при последующих разведениях, что приводит к линейной зависимости, которая не всегда может быть точной.

Основные условия и детергенты, такие как SDS, могут влиять на способность красителя связываться с белком через его боковые цепи.[9] Однако есть некоторые реагенты Брэдфорда, совместимые с моющими средствами. Анализ Брэдфорда зависит от последовательности белка. Таким образом, если белок не содержит идеального количества ароматических остатков, краситель не сможет эффективно связываться с белком. Еще один недостаток анализа протеина Брэдфорда состоит в том, что этот метод зависит от сравнения поглощения белка с поглощением стандартного белка. Если белок не реагирует на краситель так же, как стандартный белок, возможно, измеренная концентрация будет неточной.

Реагенты в этом методе имеют тенденцию окрашивать пробирки. Использовать одни и те же пробирки нельзя, поскольку пятно может повлиять на показания поглощения. Этот метод также чувствителен ко времени. Когда тестируется более одного раствора, важно убедиться, что каждый образец инкубируется в течение одинакового времени для точного сравнения.[15]

Это также ингибируется присутствием детергентов, хотя эту проблему можно облегчить добавлением циклодекстринов к смеси для анализа.[16]

Большая часть нелинейности происходит из-за равновесия между двумя различными формами красителя, которое нарушается добавлением белка. Анализ Брэдфорда линеаризует, измеряя отношение оптической плотности 595 на 450 нм. Этот модифицированный анализ Брэдфорда примерно в 10 раз более чувствителен, чем традиционный.[17]

Краситель Coomassie Blue G250, используемый для связывания с белками в оригинальном методе Брэдфорда, легко связывается с группами белков аргинина и лизина. Это недостаток, потому что предпочтение красителя связываться с этими аминокислотами может приводить к различному ответу анализа между разными белками. Для исправления этого отклонения были внесены изменения в исходный метод, такие как увеличение pH путем добавления NaOH или добавления красителя. Хотя эти модификации приводят к менее чувствительному анализу, модифицированный метод становится чувствительным к детергентам, которые могут влиять на образец.[18]

Пример процедуры Брэдфорда

Материалы

  • Лиофилизированный гамма-глобулин бычьей плазмы
  • Кумасси бриллиантовый синий 1
  • 0,15 М NaCl
  • Спектрофотометр и кюветы
  • Микропипетки

Процедура (стандартный анализ, 20-150 мкг белка; 200-1500 мкг / мл)

  1. Приготовьте серию стандартов, разбавленных 0,15 M NaCl до конечных концентраций 0 (пустой = нет белка), 250, 500, 750 и 1500 мкг / мл. Также подготовьте серийные разведения неизвестного образца для измерения.
  2. Добавьте по 100 мкл каждого из перечисленных выше веществ в отдельную пробирку (или пробирку спектрофотометра, если используется Спектроник 20 ).
  3. Добавьте 5,0 мл кумасси синего в каждую пробирку и перемешайте на вортексе или переворачивании.
  4. Настройте спектрофотометр на длину волны 595 нм, используя пробирку, не содержащую белка (бланк).
  5. Подождите 5 минут и считайте каждый из стандартов и каждый образец при длине волны 595 нм.
  6. Постройте график зависимости поглощения стандартов от их концентрации. Вычислите коэффициент экстинкции и рассчитайте концентрации неизвестных образцов.

Процедура (микроанализ, 1-10 мкг белка / мл)

  1. Подготовьте стандартные концентрации белка 1, 5, 7,5 и 10 мкг / мл. Готовят только холостой раствор NaCl. Подготовьте серию разведений образца.
  2. Добавьте по 100 мкл каждого из перечисленных выше веществ в отдельные пробирки (используйте пробирки для микроцентрифуги) и добавьте 1,0 мл кумасси синего в каждую пробирку.
  3. Включите спектрофотометр, настройте его на длину волны 595 нм и сделайте пустой спектрофотометр, используя кюветы на 1,5 мл.
  4. Подождите 2 минуты и измерьте оптическую плотность каждого стандарта и образца при 595 нм.
  5. Постройте график зависимости поглощения стандартов от их концентрации. Вычислите коэффициент экстинкции и рассчитайте концентрации неизвестных образцов.

Использование полученных данных для определения концентрации неизвестного

Таким образом, чтобы найти стандартную кривую, необходимо использовать различные концентрации БСА (бычий сывороточный альбумин).[2] чтобы создать стандартную кривую с концентрацией, нанесенной на ось x, и поглощением, нанесенной на ось y. Используется только узкая концентрация BSA (2-10 мкг / мл) для создания точной стандартной кривой.[19] Использование широкого диапазона концентраций белка затруднит определение концентрации неизвестного белка. Эта стандартная кривая затем используется для определения концентрации неизвестного белка. Далее подробно описывается, как перейти от стандартной кривой к концентрации неизвестного.

Сначала добавьте строку, которая лучше всего подходит, или Линейная регрессия и отобразите уравнение на диаграмме. В идеале R2 значение будет максимально приближено к 1. R представляет собой сумму квадратов значений соответствия, вычтенных из каждой точки данных. Следовательно, если R2 намного меньше единицы, попробуйте повторить эксперимент, чтобы получить более надежные данные.[20]

График 1. Фактические данные BSA, полученные с помощью микромасштабного спектрофотометра UV-Vis.

Уравнение, отображаемое на диаграмме, дает средства для расчета оптической плотности и, следовательно, концентрации неизвестных образцов. На графике 1 x - это концентрация, а y - оптическая плотность, поэтому необходимо перестроить уравнение, чтобы найти x и ввести оптическую плотность измеренного неизвестного.[21] Вполне вероятно, что значения оптической плотности неизвестного вещества будут выходить за пределы диапазона стандарта. Их не следует включать в расчеты, поскольку данное уравнение не может применяться к числам за пределами его ограничений. В крупном масштабе необходимо вычислить коэффициент ослабления, используя Закон Бера-Ламберта A = εLC, где A - измеренная оптическая плотность, ε - наклон стандартной кривой, L - длина кюветы, а C - определяемая концентрация.[22] В микромасштабе кювета не может использоваться, и поэтому нужно только перегруппировать, чтобы найти x.

Таблица 1. Фактические данные анализа для определения концентрации неизвестного на основе линии наилучшего соответствия приведенной выше стандартной кривой.

Для достижения концентрации, которая имеет смысл с данными, разведения, концентрации и единицы неизвестного должны быть нормализованы (таблица 1). Для этого нужно разделить концентрацию белка на объем, чтобы нормализовать концентрацию, и умножить на количество разбавленного, чтобы исправить любое разбавление, сделанное в белке перед проведением анализа.

Альтернативные анализы

Альтернативные анализы белка включают:

Рекомендации

  1. ^ а б Нинфа, Александр Дж; Баллоу, Дэвид П.; Бенор, Марили (2008). Фундаментальные лабораторные подходы к биохимии и биотехнологии. Вайли. п. 113.
  2. ^ а б c d Брэдфорд, Мэрион (1976). «Быстрый и чувствительный метод количественного определения количества белка в микрограммах, использующий принцип связывания белок-краситель» (PDF). Аналитическая биохимия. 72 (1–2): 248–254. Дои:10.1006 / abio.1976.9999. PMID  942051 - через Google Scholar.
  3. ^ «Quick Start TM Bradford Protein Assay» (PDF). www.bio-rad.com.
  4. ^ Брэдфорд, Мэрион (1976). «Быстрый и чувствительный метод количественного определения количества белка в микрограммах, использующий принцип связывания белок-краситель». ELSEVIER. 72: 248–254 - через ScienceDirect.
  5. ^ «Определение белка по методу Брэдфорда».
  6. ^ П., Баллоу, Дэвид; Марили., Бенор (2010). Фундаментальные лабораторные подходы в биохимии и биотехнологии. Джон Вили. ISBN  9780470087664. OCLC  420027217.
  7. ^ Нинфа, Баллоу, Бенор, Александр Дж., Дэвид П., Марили (2010). Фундаментальные лабораторные подходы к биохимии и биотехнологии. Соединенные Штаты Америки: John Wiley & Sons, Inc., стр. 110, 113. ISBN  978-0-470-08766-4.CS1 maint: несколько имен: список авторов (связь)
  8. ^ Нинфа, Александр Дж .; Ballou, David P .; Бенор, Марили (2010). Фундаментальные лабораторные подходы к биохимии и биотехнологии. John Wiley & Sons Inc. стр. 113. ISBN  978-0470087664.
  9. ^ а б Окутуку, Бурку; Динчер, Айше; Хабиб, Омер; Зыхныоглу, Фиген (2007-08-01). «Сравнение пяти методов определения общей концентрации белков плазмы». Журнал биохимических и биофизических методов. 70 (5): 709–711. Дои:10.1016 / j.jbbm.2007.05.009. PMID  17597224.
  10. ^ «Техническое руководство по анализу белков» (PDF).
  11. ^ «4.5. Определение концентрации белка». elte.prompt.hu. Архивировано из оригинал в 2016-09-21. Получено 2016-05-19.
  12. ^ Барбоса, Хелдер; Слейтер К.Х., Найджел (3 августа 2009 г.). «Количественное определение белка в присутствии поли (этиленгликоля) и декстрана с использованием метода Брэдфорда». Аналитическая биохимия: методы в биологических науках. 395 (1): 108–110. Дои:10.1016 / j.ab.2009.07.045. PMID  19653991.
  13. ^ Нинфа, Александр Дж. (2010). Фундаментальные лабораторные подходы к биохимии и биотехнологии. Вайли. С. 117–118. ISBN  978-0470087664.
  14. ^ Нинфа, Баллоу (1998). Фундаментальные подходы к биохимии и биотехнологии. Fitzgerald Science Press, Bethesda, MD. С. 114–116. ISBN  978-0470087664.
  15. ^ Нинфа, Александр Дж; Баллоу, Дэвид П.; Бенор, Марили (2009). Фундаментальные лабораторные подходы к биохимии и биотехнологии. Вайли. п. 113.
  16. ^ Рабийо, Тьерри (2018). «Оптимизация анализа cydex blue: одностадийный колориметрический анализ белка с использованием циклодекстринов и совместимость с детергентами и восстановителями». PLOS ONE. 13 (4): e0195755. Дои:10.1371 / journal.pone.0195755. ЧВК  5895047. PMID  29641569.
  17. ^ Зор, Цаффрир; Селинджер, Цви (1996-05-01). «Линеаризация анализа протеина Брэдфорда увеличивает его чувствительность: теоретические и экспериментальные исследования». Аналитическая биохимия. 236 (2): 302–308. Дои:10.1006 / abio.1996.0171. PMID  8660509.
  18. ^ Крюгера (2002). «Метод Брэдфорда для количественного определения белка». Метод Брэдфорда для количественного определения белка. С. 15–22. Дои:10.1385/1-59259-169-8:15. ISBN  1-59259-169-8. S2CID  36834925.
  19. ^ «Линеаризация анализа протеина Брэдфорда увеличивает его чувствительность: теоретические и экспериментальные исследования» (PDF). www.tau.ac. 20 ноября 1995 г.
  20. ^ Олбрайт, Брайан (2009). Математическое моделирование в Excel. п. 60. ISBN  978-0763765668.
  21. ^ Стивенсон, Фрэнк Гарольд (2003). Расчеты для молекулярной биологии и биотехнологии: справочник по математике в лаборатории. стр.252. ISBN  978-0126657517.
  22. ^ Ибанез, Хорхе Г. (2007). Химия окружающей среды: основы. стр.60. ISBN  978-0387260617.

дальнейшее чтение

внешняя ссылка