Синтетические геномы - Synthetic genomes

Синтетический геном - это синтетически построенный геном, формирование которого включает либо генетическая модификация на ранее существовавших формах жизни или искусственный синтез генов для создания новой ДНК или целых форм жизни.[1][2][3]. Область, изучающая синтетические геномы, называется Синтетическая геномика.

Технология рекомбинантной ДНК

Вскоре после открытия эндонуклеазы рестрикции и лигазы, область генетики начала использовать эти молекулярные инструменты для сборки искусственных последовательностей из более мелких фрагментов синтетических или встречающихся в природе ДНК. Преимущество использования рекомбинаторного подхода по сравнению с непрерывным Синтез ДНК проистекает из обратной зависимости между длиной синтетической ДНК и процентной чистотой этой синтетической длины. Другими словами, по мере того, как вы синтезируете более длинные последовательности, количество клонов, содержащих ошибки, увеличивается из-за присущего текущим технологиям уровня ошибок.[4] Несмотря на то что рекомбинантная ДНК технология чаще всего используется при строительстве слитые белки и плазмиды, появилось несколько методов с большей производительностью, позволяющих конструировать целые геномы.[5]

Полимеразный цикл сборки

Полимеразный цикл сборки. Синие стрелки представляют олигонуклеотиды от 40 до 60 п.н. с перекрывающимися областями около 20 п.н. Цикл повторяется до тех пор, пока не будет построен окончательный геном.

Сборка для циклирования полимеразы (PCA) использует серию олигонуклеотидов (или олигонуклеотидов) длиной примерно от 40 до 60 нуклеотидов, которые вместе составляют обе цепи синтезируемой ДНК. Эти олигонуклеотиды сконструированы таким образом, что один олигонуклеотид из одной цепи содержит примерно 20 нуклеотидов на каждом конце, который комплементарен последовательностям двух разных олигонуклеотидов на противоположной цепи, тем самым создавая области перекрытия. Весь набор обрабатывается циклами: (а) гибридизация при 60 ° С; (б) удлинение через Полимераза Taq и стандартная лигаза; и (c) денатурация при 95 ° C с образованием все более длинных смежных цепей и в конечном итоге приводит к окончательному геному.[6] PCA был использован для создания первого синтетического генома в истории, генома Phi X 174 вирус.[7]

Метод сборки Гибсона

Метод сборки Гибсона. Синие стрелки представляют кассеты ДНК, которые могут быть любого размера, например, 6 т.п.н. каждая. Оранжевые сегменты представляют собой области идентичных последовательностей ДНК. Этот процесс можно проводить с несколькими начальными кассетами.

В Метод сборки Гибсона, разработанный Дэниелом Гибсоном во время его работы в Институт Дж. Крейга Вентера, требуется набор кассет двухцепочечной ДНК, которые составляют весь синтезируемый геном. Обратите внимание, что кассеты отличаются от контигов по определению тем, что эти последовательности содержат области гомологии с другими кассетами для целей рекомбинация. В отличие от сборки циклического полимеразы, сборка Гибсона представляет собой одностадийную изотермическую реакцию с большей длиной последовательности; следовательно, он используется вместо сборки циклического полимеразы для геномов размером более 6 т.п.н.

В 5 экзонуклеаза выполняет реакцию жевания на концевых сегментах, работая в направлении от 5 футов до 3 футов, тем самым создавая дополнительные выступы. Свесы скрещиваются друг с другом, Phusion ДНК-полимераза заполняет все недостающие нуклеотиды, а надрезы закрывают лигазой. Однако количество геномов, которые можно синтезировать с использованием только этого метода, ограничено, поскольку по мере увеличения длины кассет ДНК им требуется размножение in vitro для продолжения гибридизации; соответственно, сборка Гибсона часто используется в сочетании с рекомбинацией, связанной с трансформацией (см. ниже) для синтеза геномов размером в несколько сотен килобаз.[8]

Рекомбинация, связанная с трансформацией

Клонирование с устранением разрывов. Синие стрелки представляют контиги ДНК. Сегменты одного цвета представляют собой дополнительные или идентичные последовательности. Специализированные праймеры с удлинениями используются в полимеразной цепной реакции для создания областей гомологии на концевых концах контигов ДНК.

Целью технологии трансформации-ассоциированной рекомбинации (TAR) в синтетической геномике является объединение контигов ДНК с помощью гомологичная рекомбинация в исполнении Искусственная хромосома дрожжей (YAC). Важное значение имеет элемент CEN в YAC. вектор, что соответствует центромере дрожжей. Эта последовательность дает вектору возможность вести себя хромосомным образом, тем самым позволяя ему выполнять гомологичная рекомбинация.[9]

Рекомбинация, связанная с трансформацией. События кроссинговера происходят между областями гомологии в кассетах и ​​векторе YAC, тем самым соединяя меньшие последовательности ДНК в один более крупный контиг.

Сначала выполняется клонирование с восстановлением разрывов для создания областей гомологии, фланкирующих контиги ДНК. Клонирование с устранением разрывов - это особая форма Полимеразной цепной реакции в которых специализировались грунтовки с расширениями за пределами последовательности ДНК-мишени.[10] Затем кассеты ДНК подвергаются воздействию вектора YAC, который запускает процесс гомологичной рекомбинации, тем самым соединяя кассеты ДНК. Сборка полимеразного цикла и технология TAR были использованы вместе для создания 600 kb. Mycoplasma genitalium геном в 2008 году, первый когда-либо созданный синтетический организм.[11] Аналогичные шаги были предприняты при синтезе большей Mycoplasma mycoides геном несколько лет спустя.[12]

Смотрите также

использованная литература

  1. ^ Йонг, Эд. "Таинственная вещь об удивительной новой синтетической клетке". Атлантический океан. Получено 2017-09-12.
  2. ^ "Вот что мы действительно могли узнать из синтетического генома человека". СТАТ. 2016-06-02. Получено 2017-09-12.
  3. ^ «Синтетический геном человека может быть не за горами - ExtremeTech». ExtremeTech. 2016-05-19. Получено 2017-09-12.
  4. ^ Монтегю, Майкл Джи; Лартиг, Кэрол; Ваши, Санджай (2012). «Синтетическая геномика: возможности и ограничения». Текущее мнение в области биотехнологии. 23 (5): 659–665. Дои:10.1016 / j.copbio.2012.01.014. PMID  22342755.
  5. ^ Гибсон, Дэниел (2011). Синтетическая биология, Часть B: Компьютерный дизайн и сборка ДНК; Глава пятнадцатая - Ферментативная сборка перекрывающихся фрагментов ДНК. Академическая пресса. С. 349–361. ISBN  978-0-12-385120-8.
  6. ^ Stemmer, Willem P.C .; Крамери, Андреас; Ха, Ким Д .; Бреннан, Томас М .; Хейнекер, Герберт Л. (1995-10-16). «Одностадийная сборка гена и всей плазмиды из большого количества олигодезоксирибонуклеотидов». Ген. 164 (1): 49–53. Дои:10.1016/0378-1119(95)00511-4. PMID  7590320.
  7. ^ Smith, Hamilton O .; Hutchison, Clyde A .; Пфаннкоч, Синтия; Вентер, Дж. Крейг (23 декабря 2003 г.). «Создание синтетического генома путем сборки всего генома: бактериофаг φX174 из синтетических олигонуклеотидов». Труды Национальной академии наук. 100 (26): 15440–15445. Дои:10.1073 / pnas.2237126100. ISSN  0027-8424. ЧВК  307586. PMID  14657399.
  8. ^ Гибсон, Дэниел Дж. Янг, Лэй; Чжуан, Рай-Юань; Вентер, Дж. Крейг; Хатчисон, Клайд А; Смит, Гамильтон О. (12 апреля 2009 г.). «Ферментативная сборка молекул ДНК до нескольких сотен килобаз». Природные методы. 6 (5): 343–345. Дои:10.1038 / nmeth.1318. PMID  19363495.
  9. ^ Куприна Наталай; Ларионов, Владимир (2003-12-01). «Использование дрожжей Saccharomyces cerevisiae для изучения организации и эволюции сложных геномов». Обзор микробиологии FEMS. 27 (5): 629–649. Дои:10.1016 / S0168-6445 (03) 00070-6. ISSN  1574-6976. PMID  14638416.
  10. ^ Марсищки, Джеральд; ЛаБер, Джошуа (2004-10-15). «Множество путей ко многим клонам: сравнительный взгляд на высокопроизводительные методы клонирования». Геномные исследования. 14 (10b): 2020–2028. Дои:10.1101 / гр.2528804. ISSN  1088-9051. PMID  15489321.
  11. ^ Гибсон, Дэниел Дж .; Benders, Gwynedd A .; Эндрюс-Пфаннкоч, Синтия; Денисова, Евгения А .; Баден-Тилсон, Холли; Завери, Джейшри; Стоквелл, Тимоти Б .; Браунли, Анушка; Томас, Дэвид В. (29 февраля 2008 г.). «Полный химический синтез, сборка и клонирование генома Mycoplasma genitalium». Наука. 319 (5867): 1215–1220. Дои:10.1126 / science.1151721. ISSN  0036-8075. PMID  18218864.
  12. ^ Гибсон, Дэниел Дж .; Гласс, Иоанн I .; Лартиг, Кэрол; Носков, Владимир Н .; Чжуан, Рай-Юань; Algire, Mikkel A .; Benders, Gwynedd A .; Монтегю, Майкл Дж .; Ма, Ли (2010-07-02). «Создание бактериальной клетки под контролем химически синтезированного генома». Наука. 329 (5987): 52–56. Дои:10.1126 / science.1190719. ISSN  0036-8075. PMID  20488990.