Технология подвесного массива - Suspension array technology

Технология подвесного массива (или же СИДЕЛ) - это высокопроизводительная, крупномасштабная и мультиплексная платформа для скрининга, используемая в молекулярная биология. SAT широко применяется для геномный и протеомный исследования, такие как однонуклеотидный полиморфизм (SNP) генотипирование, генетическое заболевание скрининг, экспрессия гена профилирование, поиск новых лекарств и клиническая диагностика.[1][2][3] SAT использует шарики микросфер (5,6 мкм в диаметре) для подготовки массивов. SAT позволяет одновременно тестировать несколько вариантов генов с помощью этих микросфер, поскольку каждый тип микросфер имеет уникальную идентификацию, основанную на вариациях оптических свойств, наиболее распространенным из которых является флуоресцентный цвет. Поскольку каждый цвет и интенсивность цвета имеют уникальную длину волны, шарики можно легко отличить по интенсивности их длины волны. Микросферы легко суспендируются в растворе и демонстрируют благоприятную кинетику во время анализа. Подобно плоским микрочипам (например, Микрочип ДНК ), подходящей молекулы рецептора, такой как ДНК олигонуклеотид зонды, антитела, или другой белки, прикрепляются к микросферам с разными обозначениями. Это производит тысячи элементов массива микросфер. Гибридизация зонд-мишень обычно обнаруживается оптически помеченными мишенями, которые определяют относительное содержание каждой мишени в образце.[4]

Обзор SAT с использованием гибридизации ДНК

Обзор процедур технологии массива суспензий с использованием гибридизации ДНК в качестве модели.

ДНК извлекается из ячеек, используемых для создания тестовых фрагментов. Эти тестовые фрагменты добавляют к раствору, содержащему различные шарики микросфер. Каждый тип бусинок микросфер содержит известный ДНК-зонд с уникальным флуоресцентный личность. Фрагментам теста и зондам на шариках микросфер дают возможность гибридизоваться друг с другом. После гибридизации гранулы микросфер сортируют, обычно используя проточной цитометрии. Это позволяет обнаруживать каждый из вариантов гена из исходного образца. Полученные в результате данные будут указывать на относительное содержание каждого гибридизированного образца в микросфере.

Мультиплексирование

Поскольку шарики микросфер легко суспендируются в растворе, и каждая микросфера сохраняет свою идентичность при гибридизации с тестируемым образцом, типичный эксперимент с массивом суспензий может анализировать широкий спектр биологических анализов в одной реакции, называемой «мультиплексированием». Как правило, каждый тип микросфер, используемых в матрице, готовится отдельно в больших объемах. Например, коммерчески доступные массивы микросфер от Luminex xMAP Technology используют массив элементов 10X10. Этот набор включает шарики с красителями красного и инфракрасного света, каждый с десятью различными интенсивностями, чтобы дать массив из 100 элементов.[4] Таким образом, размер массива будет экспоненциально увеличиваться при использовании нескольких красителей. Например, пять разных красителей с 10 разными интенсивностями на краситель дадут 100 000 различных элементов массива.

Процедура

Пример таргетинга

При использовании разных типов микросфер SAT может одновременно тестировать несколько переменных, например: ДНК и белки, в данном образце. Это позволяет SAT анализировать множество молекулярных мишеней во время одной реакции. Общее нуклеиновая кислота Метод обнаружения включает прямую гибридизацию ДНК. Подход прямой ДНК-гибридизации представляет собой простейший анализ матрицы суспензии, при котором олигонуклеотиды ДНК длиной 15-20 п.н., прикрепленные к микросферам, амплифицируются с ПЦР. Это оптимальная длина зонда, поскольку она сводит к минимуму колебания температуры плавления между различными зондами во время гибридизации зонд-мишень.[1] После амплификации одного интересующего олигозонда ДНК его можно использовать для создания 100 различных зондов на 100 различных наборах микросфер, каждый из которых способен захватывать 100 потенциальных мишеней (при использовании массива из 100 сплетений). Аналогичным образом образцы целевой ДНК обычно ПЦР усилены и помечены.[4] Гибридизация между зондом захвата и мишенью ДНК достигается плавлением и отжигом дополнительный цель ДНК последовательности к их зондам захвата, расположенным на микросферах. После промывки для удаления неспецифического связывания между последовательностями только сильно спаренные зонды-мишени останутся гибридизированными.[1]

Сортировка и обнаружение с помощью проточной цитометрии

Для получения дополнительных сведений по этой теме см. проточной цитометрии

Поскольку оптическая идентичность каждой микросферы известна, количественная оценка целевых образцов, гибридизованных с микросферами, может быть достигнута путем сравнения относительной интенсивности целевых маркеров в одном наборе микросфер с целевыми маркерами в другом наборе микросфер с использованием проточной цитометрии. Микросферы можно сортировать на основе их уникальных оптических свойств и уровня гибридизации с целевой последовательностью.

Сильные стороны

  • Быстрая / высокая производительность: В мультиплексном анализе 100-плексный анализ можно анализировать каждые 30 секунд. Недавно сообщенная высокая пропускная способность проточной цитометрии может отбирать образцы из 96-луночного планшета за 1 минуту, и теоретически анализ 100-сплетений с этой системой может быть проанализирован менее чем за 1 секунду или потенциально может доставить 12 миллионов образцов в день.[4]
  • Высокая плотность массива / мультиплексирование: По сравнению с плоскими микрочипами, SAT позволяет проводить параллельные измерения. Несколько микролитров микросфер могут содержать тысячи элементов массива, и каждый элемент массива представлен сотнями отдельных микросфер. Таким образом, измерение проточной цитометрии представляет собой повторный анализ каждого элемента массива.[4]
  • Эффективный сбор информации: Одним из преимуществ использования SAT является то, что он позволяет вам взять один образец у пациента или исследовательского организма и одновременно проверить несколько вариантов генов. Таким образом, из одного образца вы можете определить, какой вирус из серии вирусов есть у пациента или какая мутация пары оснований присутствует в организме с уникальным фенотипом.[3]
  • Экономически эффективным: В настоящее время коммерчески доступные наборы подвесок стоят от 0,10 до 0,25 долларов за каждую тестируемую последовательность.[1]

Недостатки

  • Относительно небольшой размер массива: Несмотря на то, что он может использовать увеличенное количество красителей для создания миллионов различных элементов массива, текущее поколение коммерчески доступных массивов микросфер (от технологии Luminex xMAP) использует только два набора красителей и, следовательно, может обнаруживать только ~ 100 целей на эксперимент.[4]
  • Гибридизация между различными наборами зондов и целевых последовательностей требует удельная температура отжига, на который влияет длина и последовательность олигонуклеотидного зонда. Поэтому для каждого эксперимента можно использовать только одну возможную температуру отжига. Таким образом, все зонды, используемые в данном эксперименте, должны быть разработаны для гибридизации с мишенью при одинаковой температуре. Хотя введение несовпадения пар оснований в некоторые наборы зондов может минимизировать разницу температур отжига между каждым набором зондов, проблема гибридизации все еще остается значительной, если в одной реакции тестируется более 10-20 мишеней.[1]

Рекомендации

  1. ^ а б c d е Данбар, Шерри А. (2006). «Применение технологии Luminex xMAP для быстрого и высокопроизводительного обнаружения мультиплексированных нуклеиновых кислот». Clinica Chimica Acta. 363 (1–2): 71–82. Дои:10.1016 / j.cccn.2005.06.023. ЧВК  7124242. PMID  16102740.
  2. ^ Сейдеман, Джонатан; Перитт, Дэвид (2002). «Новый метод скрининга моноклональных антител с использованием системы микросфер Luminex-100». Журнал иммунологических методов. 267 (2): 165–171. Дои:10.1016 / s0022-1759 (02) 00168-0. PMID  12165438.
  3. ^ а б Данбар, Шерри А .; Vander Zee, Coe A .; Оливер, Керри Дж .; Карем, Кевин Л .; Джейкобсон, Джеймс У. (2003). «Количественное, множественное обнаружение бактериальных патогенов: ДНК и белковые приложения системы Luminex LabMAP». Журнал микробиологических методов. 53 (2): 245–252. Дои:10.1016 / S0167-7012 (03) 00028-9. PMID  12654495.
  4. ^ а б c d е ж Нолан, Джон П .; Скляр, Ларри А. (2002). «Технология подвесных массивов: эволюция парадигмы плоских массивов». Тенденции в биотехнологии. 20 (1): 9–12. Дои:10.1016 / s0167-7799 (01) 01844-3. PMID  11742671.

внешняя ссылка