Субклонирование - Subcloning
В молекулярная биология, субклонирование это метод, используемый для перемещения определенной последовательности ДНК из родитель вектор к вектор назначения.
Субклонирование не следует путать с молекулярное клонирование, родственная техника.
Процедура
Ферменты рестрикции используются для удаления интересующего гена ( вставлять) от родителя. Вставка очищается, чтобы изолировать ее от других молекул ДНК. Обычный метод очистки гелевая изоляция. Затем количество копий гена амплифицируется с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Одновременно то же рестрикционные ферменты используются для переваривания (вырезания) места назначения. Идея использования тех же рестрикционных ферментов заключается в создании дополнительный липкие концы, что облегчит перевязка позже. А фосфатаза, обычно щелочная фосфатаза из кишечника теленка (CIAP), также добавляется для предотвращения самолигирования целевого вектора. Переваренный вектор-адресат выделяют / очищают.
Затем вставку и целевой вектор смешивают вместе с ДНК-лигазой. Типичное молярное соотношение вставляемых генов к векторам назначения составляет 3: 1;[1] при увеличении концентрации вставки самолигирование еще больше уменьшается. После выдерживания реакционной смеси в течение заданного времени при определенной температуре (в зависимости от размера лигируемых нитей; дополнительную информацию см. ДНК-лигаза ) вставка должна быть успешно включена в место назначения. плазмида.
Амплификация плазмиды продукта
Плазмида часто преобразованный в бактерия подобно Кишечная палочка. Идеально, когда бактерия разделяет плазмида также должна быть реплицирована. В лучшем случае каждая бактериальная клетка должна иметь несколько копий плазмиды. После того, как вырастет большое количество бактериальных колоний, их можно miniprepped для сбора плазмидной ДНК.
Выбор
Чтобы гарантировать рост только трансформированных бактерий (которые несут нужные плазмиды для сбора), маркерный ген используется в векторе назначения для отбор. Типичные гены-маркеры предназначены для устойчивость к антибиотикам или питательное вещество биосинтез. Так, например, «маркерный ген» может быть для устойчивости к антибиотику ампициллину. Если бы бактерии, которые должны были уловить желаемую плазмиду, уловили желаемый ген, они также содержали бы «маркерный ген». Теперь бактерии, которые захватили плазмиду, смогут расти в ампициллине, тогда как бактерии, которые не уловили желаемую плазмиду, все еще будут уязвимы для разрушения ампициллином. Следовательно, будут «отобраны» успешно трансформированные бактерии.
Примерный случай: субклонирование бактериальной плазмиды
В этом примере ген из библиотеки генов млекопитающих будет субклонирован в бактериальную плазмиду (целевую платформу). Бактериальная плазмида - это часть кольцевой ДНК, которая содержит регуляторные элементы, позволяющие бактериям производить генный продукт (экспрессия гена ), если он помещен в правильное место в плазмиде. Сайт продукции фланкирован двумя сайтами разреза рестрикционным ферментом «А» и «В» с несовместимыми липкими концами.
ДНК млекопитающих не имеет этих сайтов рестрикции, поэтому они встроены ПЦР расширения с перекрытием. Праймеры предназначены для аккуратного размещения сайтов рестрикции, так что кодирование белка происходит в рамке считывания, и минимум дополнительных аминокислот имплантируется по обе стороны от белка.
И продукт ПЦР, содержащий ген млекопитающего с новыми сайтами рестрикции, и целевую плазмиду подвергают рестрикционному расщеплению, и продукты расщепления очищают с помощью гель-электрофорез.
Продукты гидролиза, теперь содержащие совместимые липкие концы друг с другом (но несовместимые липкие концы сами с собой), подвергаются лигированию, создавая новую плазмиду, которая содержит фоновые элементы исходной плазмиды с другой вставкой.
Плазмида преобразованный на бактерии, и идентичность вставки подтверждается Секвенирование ДНК.
Смотрите также
Рекомендации
- ^ Уильямс, Стивен А .; и другие. (2006). Лабораторные исследования по молекулярной биологии. п. 213. ISBN 9780763733292.