Огатаеа полиморфная - Ogataea polymorpha

Огатаеа полиморфная это метилотрофный дрожжи с необычными характеристиками. Он используется как протеиновый завод для фармацевтические препараты.

Рис. 1. (A) Микрофотография подающий надежды О. polymorpha клетка, выращенная в хемостат в условиях метанола. Цитозоль переполнен пероксисомами (по Геллиссену). и другие. 2005).

(B) Путь метаболизма метанола в О. polymorpha (изменено после Gellissen и другие. 2005). 1 - алкогольоксидаза, 2 - каталаза, 3 - дигидроксиацетонсинтаза, 4 - формальдегиддегидрогеназа, 5 - формиатдегидрогеназа, 6 - дигидроксиацетонкиназа, 7 - GSH - глутатион, Xu5P - ксилулозо-5-фосфат, FBP - фруктоза-1,6 -бисфосфат.

Огатаеа полиморфная принадлежит к ограниченному числу видов метилотрофных дрожжей - дрожжей, которые могут расти на метанол. Ассортимент метилотрофных дрожжей включает: Candida boidinii, Pichia methanolica, Pichia pastoris и Огатаеа полиморфная. О. polymorpha таксономически является разновидностью семейства Saccharomycetaceae.

Штаммы

Три О. polymorpha штаммы, идентифицированные в 1950-х годах, известны. У них неясные отношения и независимое происхождение. Они обнаруживаются в образцах почвы, кишечнике насекомых или в испорченном концентрированном апельсиновом соке. Они обладают разными характеристиками и используются в фундаментальных исследованиях и для рекомбинантный белок производство:

• штамм CBS4732 (CCY38-22-2; ATCC34438, NRRL-Y-5445)
• штамм DL-1 (NRRL-Y-7560; ATCC26012)
• штамм NCYC495 (CBS1976; ATAA14754, NRLL-Y-1798)

Штаммы CBS4732 и NCYY495 можно скрещивать, тогда как штамм DL-1 нельзя скрещивать с двумя другими. Штаммы CBS4732 и DL-1 используются для продукции рекомбинантного белка, штамм NCYC495 в основном используется для изучения ассимиляции нитратов. геном штамма CBS4732 полностью секвенирован.

Огатаеа полиморфная представляет собой термоустойчивый микроорганизм, некоторые штаммы которого растут при температуре выше 50 ° C (122 ° F). Организм способен ассимилировать нитрат и может расти за счет ряда источников углерода в дополнение к метанол. Клетки, выращенные в условиях повышенной температуры, накапливают сахар, называемый трегалоза (этот сахар обычно содержится в насекомых) в качестве термозащитного соединения. Было показано, что синтез трегалозы необходим не для роста в этих условиях, а для приобретения термотолерантности. Синтетические этапы синтеза трегалозы подробно описаны для О. polymorpha, и TPS1, ключевой ген фермента этого пути, был выделен и охарактеризован.

Все метилотрофные дрожжи разделяют идентичный путь утилизации метанола (рис. 1). Рост на метаноле сопровождается массивным разрастанием клеток. органеллы названные пероксисомы, в которых происходят начальные ферментативные этапы этого пути. О. polymorpha представляет собой модельный организм для изучения всех аспектов пероксисомных функций и лежащей в основе молекулярной биологии. Во время роста на метаноле ферменты метаболизма метанола присутствуют в больших количествах. Особенно высокое содержание можно наблюдать для ферментов, называемых MOX (метанолоксидаза), FMDH (формиатдегидрогеназа ) и DHAS (дигидроксиацетонсинтаза). Их присутствие регулируется на транскрипционный уровень соответствующих генов. У родственных видов C. boidinii, P. methanolica, и P. pastoris этот экспрессия гена строго зависит от наличия метанола или производных метанола, тогда как в О. polymorpha сильная экспрессия вызывается соответствующими уровнями глицерина или в условиях недостатка глюкозы. О. polymorpha производит гликопротеины с двумя типами сахарных цепей к белку присоединяются N- и O-связанные гликаны. Исследования структуры N-связанных цепей выявили определенную среднюю длину (Man8-12GlcNAc2) с концевыми альфа-1,2-связанными остатками маннозы, а не с аллергенными концевыми альфа-1,3-связанными остатками маннозы, как обнаружено в других дрожжи, особенно в пекарских дрожжах Saccharomyces cerevisiae.

Биотехнологические приложения

Огатаеа полиморфная благодаря своим необычным характеристикам обеспечивает отличную платформу для генно-технологического производства белков, особенно таких фармацевтических препаратов, как инсулин для лечения сахарный диабет, гепатит Б вакцина или IFNalpha-2a для лечения гепатит С. Производные как CBS4732, так и DL-1 используются в производстве таких рекомбинантных соединений. Другие дрожжи, используемые для этого приложения: Pichia pastoris, Arxula adeninivorans и Saccharomyces cerevisiae и другие.

Как и другие дрожжи, О. polymorpha представляет собой микроорганизм, который можно культивировать в больших ферментерах до высокой плотности клеток за короткое время. Это безопасный организм, не содержащий пирогены, патогены или вирусные включения. Он может выделять соединения в культуральную среду, поскольку в нем есть все компоненты, необходимые для секреции (это, например, не относится к таким бактериям, как кишечная палочка ). Он может предоставить привлекательные генетические компоненты для эффективного производства белков.

На рис. 2 представлена ​​общая конструкция вектора (генетического носителя для трансформации штамма дрожжей в продуцента белка, созданного методами генной инженерии). Он должен содержать несколько генетических элементов: 1. Маркер отбора, необходимый для отбора трансформированного штамма из нетрансформированного фона - это можно сделать, если, например, такой элемент позволяет дефицитному штамму расти в условиях культивирования, лишенных определенного соединения, такого как конкретная аминокислота, которая не может быть произведена дефицитный штамм) 2. Определенные элементы для размножения и нацеливания чужеродной ДНК на хромосому дрожжей (последовательность ARS и / или рДНК) .3. Сегмент, ответственный за продукцию желаемого белкового соединения, так называемая экспрессионная кассета. Такая кассета состоит из последовательности регуляторных элементов, промотора, который контролирует, сколько и при каких обстоятельствах транскрибируется следующая последовательность гена и, как следствие, сколько белка в конечном итоге вырабатывается. Это означает, что сегмент, следующий за промотором, варьируется в зависимости от желаемого продукта - это может быть последовательность, определяющая аминокислоты для инсулина, вакцины против гепатита B или интерферона. Кассета экспрессии заканчивается следующей последовательностью терминатора, которая обеспечивает надлежащую остановку транскрипции. Промоутерские элементы О. polymorpha системы получены из генов, которые высоко экспрессируются, например, из гена MOX, Ящур ген или TPS1 упомянутый ранее ген. Они не только очень сильны, но также могут регулироваться путем добавления определенных источников углерода, таких как сахар, метанол или глицерин.

Рис. 2. Устройство и функционирование векторной системы CoMed. Базовый вектор CoMed содержит все Кишечная палочка элементы для распространения в Кишечная палочка система и MCS для интеграции модулей ARS, рДНК, маркера селекции и кассет экспрессии. Для этого фрагменты ARS фланкируются МешокII и BcuI сайты рестрикции, участки рДНК по Bcuя и Эко47III сайтов рестрикции, маркеры селекции по Эко47III и СалЯ ограничиваю сайты и промоутеры Саля и АпаЯ ограничиваю сайты.

В 2000 году было основано неформальное общество ученых под названием HPWN (Hansenula polymorpha всемирная сеть), основанная Мартеном Винхуисом, Гронинген, и Гердом Геллиссеном, Дюссельдорф. Каждые два года проводятся собрания.

Привлекательность О. polymorpha Платформа коммерчески используется несколькими биотехнологическими компаниями для разработки производственных процессов, в том числе PharmedArtis, расположенным в Аахене, Германия, и Leibniz-Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung (IPK).

использованная литература

Список используемой литературы

внешняя ссылка

• http://www.pharmedartis.de
• http://www.ipk-gatersleben.de/Internet/Forschung/MolekulareZellbiologie/